2.2不同干燥方式蛋清蛋白的外觀和色澤分析

如圖2所示，EWP-P為細(xì)膩的鵝黃色顆粒粉末，EWP-D為松散的黃色片狀物。EWP-P的L*、a*和b*值分別為53.90±0.23、?2.06±0.70和6.04±0.21。EWP-D的L*、a*和b*值分別為49.89±0.36、?1.65±0.26和3.84±0.50（表1）。EWP-P的b*值較大是因?yàn)榈扒宓鞍字械钠咸烟窃趪婌F干燥過(guò)程中與蛋白發(fā)生了美拉德反應(yīng)。此外，真空冷凍干燥需將樣品進(jìn)行冷凍預(yù)處理，冷凍過(guò)程中，蛋清蛋白會(huì)發(fā)生褐變反應(yīng)，故EWP-D最終呈現(xiàn)出的顏色較EWP-P黃（圖2）。EWP-P的顏色較EWP-D白（圖2），可能是因?yàn)楦蔁釃婌F干燥的干燥速度快，蛋清中的蛋白質(zhì)受熱時(shí)間短。因此在本實(shí)驗(yàn)干燥條件下，干熱噴霧干燥所得的蛋清蛋白粉更亮、更白，易被消費(fèi)者接受。

2.3不同干燥方式蛋清蛋白的內(nèi)源性熒光分析

蛋白質(zhì)的固有熒光來(lái)自于內(nèi)部的芳香族氨基殘基（酪氨酸Tyr、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe），其熒光最大值（λmax）、強(qiáng)度對(duì)其微環(huán)境的極性極其敏感，因此可用來(lái)表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，其中Trp、Tyr和Phe的特有熒光激發(fā)波長(zhǎng)分別為295、275和258 nm。如圖3所示，與EWP-C相比，不同干燥方式制備的蛋清粉的固有熒光強(qiáng)度降低但熒光峰的位置未有明顯的遷移。EWP-P的熒光強(qiáng)度低于EWP-D于EWP-C，可能是因?yàn)閲婌F干燥的干燥溫度高，蛋清蛋白變性程度大，芳香族氨基酸殘基暴露于更極性環(huán)境中，進(jìn)而發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象。此外，EWP-P的熒光強(qiáng)度較低還可能是由于蛋清蛋白中含有葡萄糖，在高溫下會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，屏蔽了芳香族氨基殘基。

圖3蛋清液及不同干燥方式EWP的內(nèi)源性熒光

2.4游離巰基和表面疏水性分析

總游離巰基包含蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和表面的游離巰基。巰基的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，如溶解度、乳化性和膠凝性能等。如圖4所示，EWP-C、EWP-P和EWP-D的總游離巰基分別是103.81±2.10、93.40±5.93和113.61±7.63μmol/L，其游離巰基分別是41.96±8.31、56.18±2.88和45.39±1.97。與EWP-C相比，EWP-P表面游離巰基含量顯著升高（P<0.05）、總游離巰基含量顯著降低（P<0.05）。而EWP-D與EWP-C相比總巰基和表面游離巰基含量差異不顯著（P>0.05）。這可能與噴霧干燥過(guò)程中卵清蛋白的變性有關(guān)，天然狀態(tài)的卵清蛋白中含有埋藏于球狀分子內(nèi)部的游離巰基，而高溫破壞了卵清蛋白的空間結(jié)構(gòu)使內(nèi)部巰基暴露在蛋白表面。三種蛋清蛋白的表面疏水性與表面游離巰基含量變化趨勢(shì)一致，EWP-C和EWP-D的表面疏水性差異不顯著（P>0.05），但其表面疏水性顯著低于EWP-P組（P<0.05），這可能也與噴霧干燥的高溫環(huán)境有關(guān)，該環(huán)境下蛋清蛋白部分展開(kāi)，導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，從而表面疏水性增高。代曉凝等將自然發(fā)酵后的蛋清液分別進(jìn)行冷凍、熱風(fēng)和噴霧干燥處理，比較三種蛋清粉與溴酚藍(lán)的結(jié)合率從而判斷其表面疏水性大小為：冷凍干燥>噴霧干燥>熱風(fēng)干燥，推測(cè)是噴霧干燥發(fā)生美拉德反應(yīng)引入親屬基團(tuán)所致。這與本文研究不一致，可能是因?yàn)榈扒迩疤幚聿煌匀话l(fā)酵時(shí)微生物可能會(huì)改變蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)。

圖4不同干燥方式蛋清粉的總游離巰基（TSH）、表面游離巰基（SH）和表面疏水性（H0）

注：相同指標(biāo)不同字母上標(biāo)表示差異顯著（P<0.05）。

2.5傅里葉變換紅外光譜分析

不同干燥方式蛋清蛋白的紅外光譜如圖5所示。EWP-P和EWP-D在酰胺A帶（3700~3200 cm?1）處有強(qiáng)吸收峰，EWP-P的峰強(qiáng)大于EWP-D，表明干燥方式會(huì)影響蛋清蛋白的水合能力，這可能與蛋白質(zhì)分子中N-H鍵舒展并與氫鍵形成了締合體，或蛋白質(zhì)分子與葡萄糖以共價(jià)鍵結(jié)合有關(guān)。酰胺B帶（2961.64 cm?1）的弱吸收峰主要由C-N鍵產(chǎn)生。酰胺I帶（1600~1700 cm?1）信號(hào)主要由C-O鍵伸縮振動(dòng)引起，與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，涉及β-折疊（1600~1640 cm?1）、無(wú)規(guī)則卷曲（1640~1650 cm?1）、α-螺旋（1650~1660 cm?1）和β-轉(zhuǎn)角（1660~1700 cm?1）。采用Peak fit軟件對(duì)不同干燥方式蛋清蛋白的酰胺I帶峰強(qiáng)進(jìn)行高斯曲線(xiàn)擬合分析，根據(jù)峰面積計(jì)算其二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量，結(jié)果如表2。EWP-P和EWP-D的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主，EWP-P的β-折疊含量增加主要與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白熱變性有關(guān)，同時(shí)分子間的β-折疊結(jié)構(gòu)也易轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。而α-螺旋下降可能是因?yàn)闊嶙冃詫?dǎo)致α-螺旋中的氫鍵斷裂，進(jìn)而發(fā)生了解螺旋現(xiàn)象。EWP-P無(wú)規(guī)則卷曲增加，表明其部分有序結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，蛋白變性明顯，結(jié)構(gòu)的隨機(jī)性增強(qiáng)。

2.6不同干燥方式蛋清蛋白的溶解度分析

溶解性是蛋白重要的功能特性之一，與接觸角、表面張力、乳化性等密切相關(guān)。如圖6A，不同pH下不同干燥方式的蛋清粉溶解度的測(cè)量。EWP-P的溶解度隨著pH的升高先減小后增大，這可能是因?yàn)樵谒嵝院蛪A性環(huán)境中球狀蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生部分展開(kāi)，形成熔融球狀構(gòu)象，變得更加靈活，更容易與水分子作用。pH為6.0時(shí)蛋清蛋白的溶解度最低，可能是因?yàn)樵損H與蛋清蛋白中大部分蛋白的等電點(diǎn)相近，蛋白帶電荷量較少，因此容易發(fā)生沉淀。與EWP-P相比，EWP-D在pH6.0時(shí)溶解度的下降程度較小，這可能與真空冷凍干燥后蛋清蛋白的微觀結(jié)構(gòu)呈片狀，具有較大的比表面積有關(guān)，也可能是因?yàn)槔鋬龈稍锏鞍踪|(zhì)在脫水過(guò)程中蛋白質(zhì)變性低，促進(jìn)了可溶性聚集物生成。EWP-D的溶解度遠(yuǎn)大于EWP-P，這是因?yàn)閲婌F干燥是直接將蛋清液霧化后再干燥，其蛋清粉表面會(huì)形成一個(gè)光滑、抗?jié)裥缘谋∧ぃ罱K導(dǎo)致蛋白的溶解性降低，復(fù)水性差且易結(jié)塊。而真空冷凍干燥經(jīng)過(guò)冷凍升華，可保持食品原有的形狀故具有很好的速溶性和復(fù)水性。Shaviklo等也發(fā)現(xiàn)噴霧干燥的含添加劑（花粉）蛋白的蛋白質(zhì)溶解度明顯低于凍干蛋白。

圖6不同干燥方式蛋清粉的功能性質(zhì)

2.7不同干燥方式蛋清蛋白的接觸角分析

接觸角值作為時(shí)間函數(shù)的變化，表征了潤(rùn)濕行為，是評(píng)價(jià)粉體潤(rùn)濕性的常用指標(biāo)。當(dāng)樣品的接觸角大于90°時(shí)，表明其疏水性較強(qiáng)，反之則親水性較強(qiáng)。不同干燥方式制備的蛋清蛋白粉與水相的接觸角如圖6B所示，EWP-P在0 s時(shí)的接觸角為99.62°，表現(xiàn)出疏水性特征；EWP-D的接觸角為65.97°，表明其具有較好的親水性。樣品與水滴接觸60 s后，由于水進(jìn)入到了粉末內(nèi)部，兩種樣品的接觸角不斷減小，EWP-P的接觸角下降到97.07°，EWP-D的接觸角下降到59.59°，EWP-D在60 s內(nèi)接觸角的下降速率更大，表明其具有更好的潤(rùn)濕性，這可能與干燥后粉末的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。冉樂(lè)童等利用掃描電鏡觀察了冷凍干燥與噴霧干燥蛋清蛋白粉的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)EWP-P粉末是球狀帶孔的結(jié)構(gòu)，且粒徑較小，而EWP-D則呈現(xiàn)出較大、松散的片狀結(jié)構(gòu)。相較于EWP-P的球狀結(jié)構(gòu)，EWP-D的松散片狀結(jié)構(gòu)可能更有利于水分在其內(nèi)部的自由流動(dòng)，因此具有更好的潤(rùn)濕性。